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segunda-feira, 26 de agosto de 2024

Começando do Básico: bibliografia sobre ictiopatologia

Como iniciar os estudos sobre uma espécie não-convencional?


Quem é da veterinária sabe que as aulas na faculdade são mais voltadas aos animais domésticos. Algumas, até dão uma pincelada sobre os animais aquáticos. Mas quantas delas aprofundam o assunto à ponto de comentar os detalhes da patologia?


Estudar patologia de peixes requer dedicação. Não será em qualquer canto que você encontrará um livro-base sobre o assunto, muito menos obras traduzidas para o português. A maioria deles ainda estão disponíveis apenas na língua inglesa, e muitos já são um pouco antigos.


Entretanto, esses atributos não retiram o valor que eles representam na medicina dessa espécie tão peculiar.


Peixes são diversos, e sua morfologia e fisiologia difere bastante dos mamíferos "tradicionais". Todo estudo bem documentado apresenta um grande valor para a pesquisa, servindo de ponto de partida para os estudos atuais.


Complementar as informações dos livros com os artigos mais recentes foi o protocolo-padrão que utilizei durante o mestrado e que continuo utilizando quando quero entender alguma informação pouco elucidada.


Pensando que você pode estar começando seus estudos na Icitopatologia, resolvi compartilhar quais livros foram fundamentais em minha jornada no Mestrado e que continuam sendo importantes referências na medicina de peixes.

Livros focados na Patologia

1. Atlas of fish histology


Literalmente um atlas de histologia de peixes. Mantê-lo por perto para consulta foi essencial durante as leituras das lâminas. Esse livro é dividido por órgãos, iniciando os capítulos com uma introdução breve sobre o tecido, seguindo com várias imagens representativas microscopicamente.

GENTEN, Franck; TERWINGHE, Eddy; DANGUY, André. Atlas of fish histology. CRC Press, 2009.

2. Fish pathology

Um excelente livro-base para entender a patogenia das alterações. Embora seja preto e branco, ele têm imagens bem detalhadas e um texto bem explicativo sobre as peculiaridades de cada tecido. Imprescindível para entender como as alterações ocorrem e como elas aparecem na microscopia.

ROBERTS, Ronald J. Fish pathology. 4ª ed. John Wiley & Sons, 2012.

3. Systemic pathology of fish: a text and atlas of comparative tissue responses in diseases of teleosts


Outro livro-base antigo mas muito bem detalhado em relação às patogenias e causas das alterações. As informações contidas nesse livro como o anterior dificilmente se encontra nos livros mais modernos. São excelentes para entender mais à fundo sobre os processos das alterações.
FERGUSON, Hugh W.; BJERKAS, Ellen; EVENSEN, Oystein. Systemic pathology of fish. A text and atlas of comparative tissue responses in diseases of teleosts. 2ª ed. Scotian Press, 2006.

Outros livros importantes de Medicina de Peixes

1. Fish Diseases


Considerado a "bíblia" da clínica de peixes. O "Fish Disease" é um clássico para aprender sobre as doenças dos peixes e as formas de tratamento. Além disso, ele conta com capítulos específicos sobre como proceder um atendimento clínico, exames complementares e fala a respeito dos sistemas de criação na piscicultura. É um livro bem completo para quem trabalha com essa espécie.
NOGA, Edward J. Fish disease: diagnosis and treatment. 2ª ed. John Wiley & Sons, 2010.

2. Fundamentals of ornamental fish health


Outra bibliografia bem completa sobre clínica de peixes Porém, diferente do Noga (que abrange peixes de forma geral), nesse livro ele foca mais nos peixes ornamentais.

ROBERTS, Helen E. (Ed.). Fundamentals of ornamental fish health. John Wiley & Sons, 2011.

3. Fish diseases and medicine


De todos os livros citados aqui, esse é o mais recente (lançado em 2019). Entretanto, ele é o mais resumido; eu o utilizei para consultas rápidas, pois ele não aprofunda nos assuntos das doenças (oferece mais uma visão geral). Caso você já tenha acesso aos outros e precisa apenas de um "manual rápido", esse livro pode atender suas necessidades. Agora, se está começando e precisando entender as lesões e afecções com mais detalhes, sugiro que escolha os outros, preferencialmente o "Fish Pathology", "Systemic Pathology of Fish" e/ou o "Fish Diseases".

SMITH, Stephen A. (Ed.). Fish diseases and medicine. CRC Press, 2019.


Esses 6 livros foram os principais em meus estudos em ictiopatologia. Pesquisando pela Internet (principalmente na Amazon), é possível encontrar muitos outros. Entretanto, ainda não tive contato com eles, por isso não os incluí nessa lista.

Você já conhecia alguns deles? Usa algum diferente?

Fale para a gente aqui embaixo quais livros você gosta de usar quando mergulha na Ictiopatologia. :)

segunda-feira, 19 de agosto de 2024

Necropsia de peixes pequenos: micro-estruturas, macro-problemas

O quão difícil é abrir um indivíduo de 6cm, escorregadio e “molinho”, difícil de manter estável para um corte preciso?

Esse foi um dos meus desafios quando iniciei meu projeto de mestrado. 

Bettas são peixes ornamentais pequenos e com os órgãos concentrados na metade do tronco à porção cranial, o que contribui para a falta de um ponto de equilíbrio homogêneo do corpo do animal, uma vez que a porção cranial é mais pesada e densa, enquanto a porção caudal é literalmente só a cauda (afunilada).

Conseguir mantê-los firmes para fazer uma abertura que não destrua muito do tecido adjacente exigiu destreza e coordenação. Obviamente que, no início, minhas incisões estavam longe de merecer um selo de qualidade. 

Entretanto, o tempo, a prática e as conversas/convivência com outros pesquisadores me auxiliaram a desenvolver novas técnicas para abrir esses indivíduos tão diminutos sem comprometer a amostra.

Se você veio parar nesse artigo, ou está interessado na necropsia de peixes diminutos, ou já está imerso nessa área e precisando de uma luz. 

Pensando nisso, resolvi compartilhar com vocês algumas dicas que foram muito úteis para mim durante minha jornada no laboratório de patologia lidando com esses pequenos aquáticos.


1. Tenha as ferramentas certas

Animais pequenos requerem instrumentos compatíveis com seu tamanho. 

Se tem um item que foi minha maior aliada foi a tesoura oftálmica. Adquiri uma curva e uma reta nos tempos em que comprar itens importados não era taxados, logo, comprei quatro delas (dois pares de cada) numa promoção na AliExpress.


Infelizmente, o valor dessas tesouras no mercado nacional é alto se comparado com as tesouras comuns. Porém, o custo-benefício compensa cada centavo: a precisão do corte e a facilidade dela acessar as pequenas cavidades e estruturas dos meus bettas fizeram uma grande diferença ao final do serviço.

Se possível, invista em pelo menos uma!

Bisturi cabo 3 e tesouras cirúrgicas comuns (como a Íris) de no máximo 12cm também são bem úteis durante a necropsia de peixes pequenos. 


2. Seja criativo

Para nossa tristeza, o mercado não dispõe de tantas opções para manusear animais tão pequenos. Portanto, é necessário pensar em “gambiarras” (ou DIY, se preferir) que atendam suas necessidades utilizando o arsenal disponível em suas mãos.

Quando eu precisava manter meus peixes em decúbito dorsal, eu improvisava uma bucha de cozinha como canaleta: faça um corte retilíneo no centro da bucha (com estilete mesmo), preferencialmente do lado amarelo (menos abrasivo), de forma que o peixe que está lidando consiga se acomodar no espaço sem ficar tombando e/ou curvando.

Se o peixe for muito escorregadio e estiver com dificuldade de fazer o corte medular (2ª etapa da eutanásia), você pode aproveitar o próprio saquinho plástico (se disponível) no qual o peixe veio para te dar suporte. Após a sedação profunda (tenha certeza que todos os sinais de sedação estejam presentes), coloque o peixe dentro do saquinho sem água, com o dorso voltado para o fundo do saco (onde fica a “costura”). Pressione o saquinho do lado oposto (ventre do peixe) para selar a passagem e pressioná-lo contra o lado da costura, de forma que não fique espaço e o corpo não seja capaz de deslizar. Feito isso, faça o corte medular sobre o próprio saquinho (ele e o peixe serão cortados).

Use o que estiver ao seu favor para adaptar ferramentas que cumpram uma função de forma eficiente. Ela não precisa ser bonita; apenas precisa funcionar.


3. Pense em acessórios extras

Um item que me ajudou na hora de enxergar detalhes (como separar arcos branquiais) foi uma lupa de cabeça. Após um tempo ajustando e se adaptando, ela é uma mão-na-roda para visualizar as microestruturas do animal, principalmente do lado interno, garantindo cortes mais precisos.


Ferramentas de manicure também foram úteis em algumas etapas, devido ao seu material resistente (muitos são de inox) e pela extremidade de alta precisão (ponta fina, por exemplo).


Balanças de precisão (igual dos joalheiros) são excelentes para pesar esses pequenos animais, mas se atente para que ela seja bem calibrada. Esse tipo de balança é bem conveniente para quem vai fazer necropsia à campo; além de portáteis, algumas marcas entregam uma precisão admirável, principalmente em miligramas.


4. Não recomendo…

Em minha vivência, um instrumento que eu mantive bem longe dos meus peixes após algumas experiências negativas foi a pinça dente-de-rato. Bettas não eram só pequenos, mas também delicados; a dente-de-rato danificava o tecido facilmente, literalmente rasgando a pele dos indivíduos na hora que eu tentava rebatê-la. Mesmo com pouca pressão ela perfurava e rasgava. Pode ser que você tenha outra técnica (ou sorte), mas, com essa espécie, não vi vantagens em levar uma dente-de-rato comigo.

Ainda hoje, continuo procurando meios para aprimorar minhas necropsias. Aprender a lidar com a espécie da minha pesquisa exigiu prática, muitas tentativas e, principalmente, troca de informação com outros colegas da área. O importante é continuar pensando em formas de aperfeiçoar seu trabalho, sem desistir diante das falhas.


Embora essas dicas tenham dado bastante certo comigo, lembre-se que cada espécie é única. O que funcionou comigo, não necessariamente irá funcionar com você. 

Não existe uma regra universal para todos os projetos. Porém, caso esteja com dificuldade em abrir seus peixinhos, experimente algumas dessas dicas para ver se elas se ajustam à você.

Você já tinha tentado alguma delas?


domingo, 28 de julho de 2024

Qual a melhor coloração para suas lâminas?

Durante meu mestrado, encontrei alterações em meus peixes que não estavam dentro do esperado (como toda pesquisa!). 

A necessidade por colorações especiais logo bateu à minha porta,  e nesse momento, me veio a  clássica dúvida de iniciante: qual coloração irá fornecer a resposta que preciso?


Escolher a coloração certa é de suma importância para investigar alterações e esclarecer achados que não são tão óbvios. Além disso, saber escolher também será fundamental para evitar retrabalho e gastos desnecessários de recursos do laboratório, sem contar o tempo desperdiçado.


Se está iniciando a jornada na patologia, continue lendo esse artigo; irei dividir com você as principais colorações que utilizei em meu mestrado e por qual propósito.

Será que tem alguma que você não conhece?

Hematoxilina-eosina: sua companheira do dia-a-dia


Não há coloração de rotina mais comum do que a hematoxilina-eosina (HE), e comigo não foi diferente.


A HE foi a base de todas as minhas lâminas; apenas ao detectar alterações suspeitas que o material era enviado para as colorações especiais.


A HE permite diferenciarmos as estruturas em dois tipos:

  • Basófilas: substâncias que se atraem por corante básico, geralmente de caráter ácido;

  • Acidófilas: substâncias que se atraem por corante ácido, geralmente básicos.


Estruturas coradas pela hematoxilina (basofílica) apresentarão um tom de roxo-azul, enquanto aquelas coradas pela eosina (acidófila) irão se corar em tons de vermelho-rosa.


A intensidade da coloração depende de alguns fatores:

  • característica ácida ou básica das estruturas. O núcleo, por exemplo, tende a manifestar um tom de azul-roxo bem escuro por conta da alta concentração de ácidos nucleicos;

  • tempo de coloração, variando por protocolo (quantos minutos você deixa no corante?);

  • qualidade do corante. Corantes velhos/reutilizados em demasia tendem a perder eficiência. 


Em alguns casos, alguns ectoparasitas eram perfeitamente visíveis sob o HE, como Ichthyophthirius multifiliis, Trichodina spp. e Monogeneas.

Investigando micro-organismos


Embora a HE forneça bastante informações sobre o estado do tecido, nem sempre é possível fechar o diagnóstico de alguns micro-organismos, como bactérias. Você pode até enxergá-las, mas vai precisar confirmar!


Nesses casos, o uso de colorações especiais se faz necessário para validar suas suspeitas. Portanto, utilizei as seguintes colorações em algumas das minhas lâminas questionáveis:

Gram

Lembra das aulas de microbiologia? O princípio aqui será o mesmo!


Essa técnica nos permite diferenciar bactérias gram-negativas e gram-positivas.


Bactérias gram-positivas vão apresentar tons de azul-roxo enquanto as gram-negativas exibirão uma tonalidade vermelha-rósea.

Ziehl-Neelsen e Fite-Faraco

Nem toda bactéria é susceptível à coloração tradicional de Gram!


Algumas, como os bacilos álcool-ácido resistentes (BAAR), exigem técnicas mais específicas para serem evidenciadas na histologia. Você precisará conhecer essas técnicas quando estiver lidando com micobactérias e Nocardia spp, por exemplo.


Para essas, é preciso utilizar outro tipo de coloração, como Ziehl-Neelsen (ZN) e Fite-Faraco (FF). O FF consiste em uma adaptação da ZN: é adicionado um óleo vegetal (amendoim, oliva) no xilol durante o processo de desparafinização.


Através dessas colorações, as BAAR adquirem um tom de vermelho-rosa enquanto o fundo/restante dos tecidos apresentarão um tom azulado.

Giemsa

Muito utilizado para a análise de parasitas no sangue, a coloração de Giemsa também pode ser utilizada na histologia para detectar protozoários em cortes de tecidos.


Quando positivo, os parasitas se destacam por uma coloração azul escura, enquanto o fundo pode exibir tons de azul mais claro ou rosa.

Periodic acid–Schiff (PAS)

A PAS é capaz de evidenciar alguns parasitas e fungos, exibindo um tom de vermelho-róseo quando positivo.


Além disso, ela também é comumente utilizada para a identificação de polissacarídeos complexos, como glicogênio, glicoproteínas e mucoproteínas.

Desvendando pigmentos


Pigmentos rosados, castanhos…

Meus peixes exibiram gotículas hialinas e acastanhadas principalmente em fígado e rim. Seriam depósitos de ferro? Proteína?


Para dar uma luz além da do microscópio, utilizei 3 colorações especiais para desvendar o mistério desses pigmentos.

PAS 

Aparecendo mais uma vez por aqui, mas para um propósito diferente: corar as gotículas rosas que encontrava com frequência no fígado. Assim como na investigação de parasitas, estruturas positivas ao PAS irão se manifestar com tons de vermelho-rosa.

Perls

Para entender a natureza dos pigmentos castanhos, utilizei o Perls para confirmar se eles se tratavam de hemossiderina ou melanomacrófagos.


Quando positivo, as estruturas que contém ferro apresentarão uma coloração azul-escura.

Fontana-Masson

Bettas apresentam bastante pigmentos, e esses pigmentos podem variar de acordo com a cor do indivíduo e podem ser encontrados em tecidos além da epiderme/derme.


Para a confirmação de pigmentos de melanina em alguns tecidos dos meus peixes, foi utilizado a coloração de Fontana-Masson. Essa técnica consiste na redução de sais de prata, fornecendo um tom enegrecido na estrutura em um fundo rosado quando positivo.


Em suma...


Podemos resumir o post com a seguinte tabela:


Rotina/Visão Geral

Parasitas

Bactérias

Polissacarídeos

Ferro

Melanina

Hematoxilina-eosina

X

X*





Gram



X




Ziehl-Neelsen



X*




Fite-Faraco



X*




Giemsa


X





PAS


X


X



Perls





X


Fontana-Masson






X

(*) Condições específicas. Reveja o texto para detalhes.

Saber o propósito de cada coloração é essencial na hora de decidir qual usar.

A histopatologia é uma caixinha de surpresa; nunca sabemos o que podemos encontrar antes de visualizarmos as lâminas sob o microscópio.

Entretanto, assim como outras áreas da vida, uma vez visualizado o "problema", é preciso ter um plano bem esclarecido para solucioná-lo. Você já tem uma suspeita? Qual o objetivo da coloração? Que resposta espera obter?

Lembre-se que alguns peixes são minúsculos e você não terá o luxo de ficar cortando o bloco toda hora para refazer colorações; uma hora (e tão breve possível) o tecido acaba.

Hoje, trouxe apenas as colorações que utilizei em meu projeto, mas existem muitas outras a serem exploradas nesse mundo de corantes especiais!

Quanto mais você estudar, mais fácil será na hora de tomar decisões, e mais precisos serão seus resultados.


Vivian Kida


Começando do Básico: bibliografia sobre ictiopatologia

Como iniciar os estudos sobre uma espécie não-convencional? Quem é da veterinária sabe que as aulas na faculdade são mais voltadas aos anima...