Qual a melhor coloração para suas lâminas?

Durante meu mestrado, encontrei alterações em meus peixes que não estavam dentro do esperado (como toda pesquisa!). 

A necessidade por colorações especiais logo bateu à minha porta,  e nesse momento, me veio a  clássica dúvida de iniciante: qual coloração irá fornecer a resposta que preciso?

Escolher a coloração certa é de suma importância para investigar alterações e esclarecer achados que não são tão óbvios. Além disso, saber escolher também será fundamental para evitar retrabalho e gastos desnecessários de recursos do laboratório, sem contar o tempo desperdiçado.

Se está iniciando a jornada na patologia, continue lendo esse artigo; irei dividir com você as principais colorações que utilizei em meu mestrado e por qual propósito.

Será que tem alguma que você não conhece?

Hematoxilina-eosina: sua companheira do dia-a-dia

Não há coloração de rotina mais comum do que a hematoxilina-eosina (HE), e comigo não foi diferente.

A HE foi a base de todas as minhas lâminas; apenas ao detectar alterações suspeitas que o material era enviado para as colorações especiais.

A HE permite diferenciarmos as estruturas em dois tipos:

• Basófilas: substâncias que se atraem por corante básico, geralmente de caráter ácido;

• Acidófilas: substâncias que se atraem por corante ácido, geralmente básicos.

Estruturas coradas pela hematoxilina (basofílica) apresentarão um tom de roxo-azul, enquanto aquelas coradas pela eosina (acidófila) irão se corar em tons de vermelho-rosa.

A intensidade da coloração depende de alguns fatores:

• característica ácida ou básica das estruturas. O núcleo, por exemplo, tende a manifestar um tom de azul-roxo bem escuro por conta da alta concentração de ácidos nucleicos;

• tempo de coloração, variando por protocolo (quantos minutos você deixa no corante?);

• qualidade do corante. Corantes velhos/reutilizados em demasia tendem a perder eficiência. 

Em alguns casos, alguns ectoparasitas eram perfeitamente visíveis sob o HE, como Ichthyophthirius multifiliis, Trichodina spp. e Monogeneas.

Investigando micro-organismos

Embora a HE forneça bastante informações sobre o estado do tecido, nem sempre é possível fechar o diagnóstico de alguns micro-organismos, como bactérias. Você pode até enxergá-las, mas vai precisar confirmar!

Nesses casos, o uso de colorações especiais se faz necessário para validar suas suspeitas. Portanto, utilizei as seguintes colorações em algumas das minhas lâminas questionáveis:

Gram

Lembra das aulas de microbiologia? O princípio aqui será o mesmo!

Essa técnica nos permite diferenciar bactérias gram-negativas e gram-positivas.

Bactérias gram-positivas vão apresentar tons de azul-roxo enquanto as gram-negativas exibirão uma tonalidade vermelha-rósea.

Ziehl-Neelsen e Fite-Faraco

Nem toda bactéria é susceptível à coloração tradicional de Gram!

Algumas, como os bacilos álcool-ácido resistentes (BAAR), exigem técnicas mais específicas para serem evidenciadas na histologia. Você precisará conhecer essas técnicas quando estiver lidando com micobactérias e Nocardia spp, por exemplo.

Para essas, é preciso utilizar outro tipo de coloração, como Ziehl-Neelsen (ZN) e Fite-Faraco (FF). O FF consiste em uma adaptação da ZN: é adicionado um óleo vegetal (amendoim, oliva) no xilol durante o processo de desparafinização.

Através dessas colorações, as BAAR adquirem um tom de vermelho-rosa enquanto o fundo/restante dos tecidos apresentarão um tom azulado.

Giemsa

Muito utilizado para a análise de parasitas no sangue, a coloração de Giemsa também pode ser utilizada na histologia para detectar protozoários em cortes de tecidos.

Quando positivo, os parasitas se destacam por uma coloração azul escura, enquanto o fundo pode exibir tons de azul mais claro ou rosa.

Periodic acid–Schiff (PAS)

A PAS é capaz de evidenciar alguns parasitas e fungos, exibindo um tom de vermelho-róseo quando positivo.

Além disso, ela também é comumente utilizada para a identificação de polissacarídeos complexos, como glicogênio, glicoproteínas e mucoproteínas.

Desvendando pigmentos

Pigmentos rosados, castanhos…

Meus peixes exibiram gotículas hialinas e acastanhadas principalmente em fígado e rim. Seriam depósitos de ferro? Proteína?

Para dar uma luz além da do microscópio, utilizei 3 colorações especiais para desvendar o mistério desses pigmentos.

PAS 

Aparecendo mais uma vez por aqui, mas para um propósito diferente: corar as gotículas rosas que encontrava com frequência no fígado. Assim como na investigação de parasitas, estruturas positivas ao PAS irão se manifestar com tons de vermelho-rosa.

Perls

Para entender a natureza dos pigmentos castanhos, utilizei o Perls para confirmar se eles se tratavam de hemossiderina ou melanomacrófagos.

Quando positivo, as estruturas que contém ferro apresentarão uma coloração azul-escura.

Fontana-Masson

Bettas apresentam bastante pigmentos, e esses pigmentos podem variar de acordo com a cor do indivíduo e podem ser encontrados em tecidos além da epiderme/derme.

Para a confirmação de pigmentos de melanina em alguns tecidos dos meus peixes, foi utilizado a coloração de Fontana-Masson. Essa técnica consiste na redução de sais de prata, fornecendo um tom enegrecido na estrutura em um fundo rosado quando positivo.

Em suma...

Podemos resumir o post com a seguinte tabela:

	Rotina/Visão Geral	Parasitas	Bactérias	Polissacarídeos	Ferro	Melanina
Hematoxilina-eosina	X	X*
Gram			X
Ziehl-Neelsen			X*
Fite-Faraco			X*
Giemsa		X
PAS		X		X
Perls					X
Fontana-Masson						X

(*) Condições específicas. Reveja o texto para detalhes.

Saber o propósito de cada coloração é essencial na hora de decidir qual usar.

A histopatologia é uma caixinha de surpresa; nunca sabemos o que podemos encontrar antes de visualizarmos as lâminas sob o microscópio.

Entretanto, assim como outras áreas da vida, uma vez visualizado o "problema", é preciso ter um plano bem esclarecido para solucioná-lo. Você já tem uma suspeita? Qual o objetivo da coloração? Que resposta espera obter?

Lembre-se que alguns peixes são minúsculos e você não terá o luxo de ficar cortando o bloco toda hora para refazer colorações; uma hora (e tão breve possível) o tecido acaba.

Hoje, trouxe apenas as colorações que utilizei em meu projeto, mas existem muitas outras a serem exploradas nesse mundo de corantes especiais!

Quanto mais você estudar, mais fácil será na hora de tomar decisões, e mais precisos serão seus resultados.

Vivian Kida